Ｎｒｆ２在牙周炎诱发大鼠肝损伤的作用

　　初步探讨核因子Ｅ２相关因子２（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｅｒｙｔｈｒｏｉｄ２ｒｅｌａｔｅｄｆａｃｔｏｒ２，Ｎｒｆ２）在牙周炎诱发大鼠肝损伤中的作用。方法：将２４只雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠随机分成正常组和牙周炎组，每组各１２只。采用０．２ｍｍ正畸丝结扎大鼠单侧上颌第一磨牙牙颈部并接种牙龈卟啉单胞菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌ，Ｐｇ）的方法建立牙周炎模型。

　　建模６周后，１０％水合氯醛麻醉下记录牙龈出血指数、牙周探诊深度、牙齿松动度；采用组织病理学、免疫组织化学方法和实时荧光定量聚合酶链反应（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ｑＲＴ－ＰＣＲ）分别检测肝损伤情况及肝组织中Ｎｒｆ２、Ｋｅｌｃｈ样环氧氯丙烷相关蛋白１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅＥＣＨ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ１，Ｋｅａｐ１）和醌氧化还原酶－１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ｑｕｉｎｏｎｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ－１，ＮＱＯ－１）的ｍＲＮＡ和蛋白的表达。结果：牙周炎组大鼠牙周组织出现明显炎症反应；牙周炎大鼠肝组织内肝索结构紊乱，肝细胞变性、坏死；Ｎｒｆ２、ＮＱＯ－１的ｍＲＮＡ表达水平低于正常组，Ｋｅａｐ１高于正常组；牙周炎大鼠Ｎｒｆ２蛋白表达水平低于正常组。结论：Ｎｒｆ２在牙周炎诱发大鼠肝损伤中发挥着重要作用。

　　［关键词］牙周炎；肝损伤；核因子Ｅ２相关因子２

　　牙周炎主要是由牙周致病菌导致的牙周支持组织逐渐破坏的一种慢性炎症性疾病。不仅影响牙齿功能，而且与全身系统性疾病密切相关［１］。有学者指出，牙周炎会导致大鼠肝脏异常，这一改变可能与氧化应激反应有关［２］，但具体机制尚不清楚。牙周炎时，牙周组织受到细菌（如牙龈卟啉单胞菌）等病原微生物的侵害，牙周组织内炎细胞聚集，中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞等以“呼吸爆发”的方式产生大量的活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ），当ＲＯＳ的生成量超过抗氧化剂的代偿能力时，形成氧化应激。此时，牙周组织内大的ＲＯＳ可经血液循环到达肝脏，进而引发肝脏氧化应激反应［３］。Ｎｒｆ２作为一种重要的内源性抗氧化剂转录因子，通过与抗氧化反应元件相互作用可防止ＲＯＳ损伤细胞。研究发现牙周炎大鼠牙周组织中Ｎｒｆ２的表达下调［４］；且肝脏氧化应激状态下，Ｎｒｆ２、ＮＱＯ－１的表达下调，Ｋｅａｐ１的表达上调，故而推测牙周炎大鼠肝损伤可能与Ｎｒｆ２下调有关。为了验证这一假设，本研究通过动物实验，初步探讨Ｎｒｆ２在牙周炎诱发大鼠肝损伤中的作用。

　　１材料与方法

　　１．１主要试剂及设备牙龈卟啉单胞菌株ＰｇＡＴＣＣ３３２７７（ＡＴＣＣ，美国）；羧甲基纤维素钠、ＤＡＢ显色试剂盒（索莱宝科技有限公司，北京）；卡那霉素（源叶生物科技有限公司，上海）；Ｎｒｆ２抗体（Ｐｒｏ－ｔｅｉｎｔｅｃｈ，美国）；引物由ＴａＫａＲａ公司设计合成；逆转录试剂盒、ＳＹＢＲＰｒｉｍｅ－ＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴ－ＰＣＲＫｉｔ试剂盒（ＴａＫａＲａ，日本）；兔超敏二步法免疫组化试剂盒（北京中杉金桥公司，北京）；低温高速离心机（Ｔｈｅｒｍｏ，美国）；实时荧光定量ＰＣＲ仪ＭＸ３００５Ｐ（ＡｇＩＬｅｎｔ，美国）；光学显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ，日本）。１．２实验动物及分组２４只ＳＰＦ级雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠（吉林大学实验动物中心），体重２００～２２０ｇ，建模１周前，卡那霉素（１ｇ／Ｌ）喂养３ｄ，后４ｄ正常饮水。实验分为正常组和牙周炎组，每组１２只。牙周炎组（Ｐ组）：０．２ｍｍ正畸丝结扎单侧上颌第一磨牙牙颈部，并接种１００μＬ含有１×１０９ＣＦＵｓＰｇ活菌的２％羧甲基纤维素钠悬浮液；正常组（Ｃ组）：同位置接种等量２％羧甲基纤维素钠悬浮液。隔天１次，连续６周［５］。动物实验经吉林大学口腔医院伦理委员会批准（批准文号：２０１９年口腔审第６４号）。１．３实验方法１．３．１牙周组织检查１０％水合氯醛（每１００ｇ体重给药量为０．３ｍＬ）麻醉下，肉眼观察并记录牙龈出血指数、牙周探诊深度、牙齿松动度。牙龈出血指数：０＝牙龈健康，无炎症及出血；１＝牙龈颜色有炎症性改变，探诊不出血；２＝探诊后有点状出血；３＝探针出血沿牙龈缘扩散；４＝出血流满并溢出龈沟；５＝自动出血。牙周探诊深度：用工作端直径０．２ｍｍ的牙周探针在大鼠上颌第一磨牙的颊、腭侧近中、中央、远中６个点进行测量，并取其平均值。牙齿松动度：０＝生理活动度；１＝颊（唇）舌向有松动；２＝颊（唇）舌向和近远中方向均松动；３＝颊（唇）舌、近中远中和垂直方向均松动。以上各项牙周临床指标均由同一人检查并记录。１．３．２组织病理学和免疫组织化学分析牙周组织检查完成后，将大鼠处死取其肝组织，１０％中性甲醛固定２４～４８ｈ，乙醇梯度脱水，二甲苯溶液透明，浸蜡，石蜡包埋，制作４μｍ的组织切片。苏木精－伊红（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎ，ＨＥ）染色，用二甲苯将肝组织切片脱蜡３次，每次１５ｍｉｎ；脱蜡完成后，将切片置于梯度乙醇中水化，之后滴加苏木素染液染色１０ｍｉｎ；冲洗干净后放入１％盐酸酒精中分化，分化后返蓝，之后滴加１％伊红染色５ｍｉｎ；完成染色后，用梯度乙醇脱水，并放入二甲苯中透明２次，透明后，滴加中性树胶，盖玻片封片并在光学显微镜下观察肝组织的病理学变化。免疫组织化学分析Ｎｒｆ２的蛋白表达。将肝组织切片脱蜡，置于梯度乙醇中水化，柠檬酸钠溶液进行抗原修复，一抗选择兔抗鼠Ｎｒｆ２多克隆抗体（１∶５０），之后严格按照兔超敏二步法免疫组化试剂盒说明书进行操作，ＤＡＢ显色后，流水冲洗终止反应，苏木素染液复染１ｍｉｎ，分化，返蓝，常规脱水透明，最后滴加中性树胶，盖玻片封片后光学显微镜下观察并拍照。１．３．３ｑＲＴ－ＰＣＲ处死大鼠后，取新鲜肝组织，液氮研磨，Ｔｒｉｚｏｌ法提取组织中的总ＲＮＡ，逆转录成ｃＤＮＡ，采用ＳＹＢＲＰｒｉｍｅ－ＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴ－ＰＣＲＫｉｔ试剂盒进行ｑＲＴ－ＰＣＲ反应。以β－ａｃｔｉｎ为内参，检测Ｎｒｆ２、Ｋｅａｐ１和ＮＱＯ－１ｍＲＮＡ表达情况。引物序列见表１。反应条件：９５℃预变性３０ｓ；９５℃变性５ｓ；６０℃退火３０ｓ，共４０个循环。采用２－ΔΔＣｔ法计算基因相对表达量。１．３．４统计学分析应用ＳＰＳＳ２１．０统计软件进行分析，计算资料均以珚ｘ±ｓ表示，组间采用ｔ检验比较分析差异，Ｐ＜０．０５表明差异有统计学意义。

　　２结果

　　２．１牙周组织检查肉眼观察正常组牙龈组织颜色粉红，菲薄而紧贴牙面，质地韧（图１ａ，如黑色箭头所示）；牙周炎组牙龈红肿，探诊出血，质地松软（图１ｂ，如黑色箭头所示）。牙龈出血指数、牙周探诊深度、牙齿松动度，见表２。２．２组织病理学分析ＨＥ染色可见，正常组大鼠肝组织内肝细胞胞质丰富，未见变性、坏死及脂肪性变，以中央静脉为中心，单行排列成肝细胞索（图２ａ、２ｂ，如黑色箭头所示）；牙周炎组大鼠肝组织内肝索结构紊乱，肝细胞变性，中央静脉周围可见广泛的空泡样脂肪变性（图２ｃ、２ｄ，如黑色箭头所示）。２．３免疫组织化学分析免疫组织化学分析Ｎｒｆ２的蛋白阳性信号主要定位于细胞质和细胞核，表现为棕黄色。牙周炎组大鼠肝组织中棕黄色阳性表达明显低于正常组（图３，红色箭头所示为细胞质，黑色箭头所示为细胞核）。２．４ｑＲＴ－ＰＣＲ检测ｑＲＴ－ＰＣＲ检测大鼠肝组织中Ｎｒｆ２、Ｋｅａｐ１和ＮＱＯ－１的ｍＲＮＡ表达情况。结果显示，牙周炎组大鼠肝组织中Ｎｒｆ２和ＮＱＯ－１的ｍＲＮＡ表达水平低于正常组；Ｋｅａｐ１的ｍＲＮＡ表达水平高于正常组，见表３。

　　３讨论

　　牙周炎是以牙周结缔组织破坏和牙槽骨吸收为特点的一种慢性炎症性疾病。大量研究证实了牙周炎与全身系统性疾病之间的关联，例如糖尿病、呼吸系统疾病、骨质疏松症和心血管疾病等。越来越多的证据表明，牙周炎也可能参与肝脏疾病的进展，例如非酒精性脂肪肝，肝硬化和肝细胞癌，并影响肝移植。最近，Ｍｅｓｔｅｒ等［６］发现牙周炎可引起大鼠肝组织丙二醛（ＭＤＡ）、谷胱甘肽（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）等氧化应激指标的改变。Ｎｒｆ２是抗氧化应激的主要转录因子之一，调节线粒体动力学，维持线粒体的结构和功能，在所有人体组织中广泛表达。在生理条件下，Ｎｒｆ２通过与Ｋｅａｐ１－Ｃｕｌ３－Ｒｂｘ１复合体结合而在细胞质中受到限制。在氧化应激状态下，Ｎｒｆ２从Ｋｅａｐ１释放到细胞核，并与一种小Ｍａｆ蛋白发生二聚化形成复合物。该复合物激活了一系列抗氧化和细胞保护蛋白ＡＲＥ依赖基因（ＮＱＯ－１、ＨＯ－１、ＣＡＴ等）的表达［７］。此外，Ｋｅａｐ１作为抑制剂，与Ｎｒｆ２相互作用形成复合物，从而阻止Ｎｒｆ２通过转录激活［８］。研究表明，在肝脏疾病中，Ｎｒｆ２的激活通常被认为是有益的，Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ－Ｔａｇｏ等［９］发现核因子κＢ（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ－ｋａｐｐａＢ，ＮＦ－κＢ）信号通路与Ｎｒｆ２之间存在功能性串扰，Ｎｒｆ２的激活可抑制脂多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）诱导的炎症反应及Ｔｏｌｌ样受体４（ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ４，ＴＬＲ４）／ＮＦ－κＢ介导的炎性细胞因子的表达。在ＬＰＳ／Ｄ－半乳糖胺（Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，Ｄ－ＧａｌＮ）刺激下，ＮＦκＢ被激活并促进促炎性因子的释放，例如肿瘤坏死因子－α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ－α，ＴＮＦ－α），白细胞介素－６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６，ＩＬ－６）和白细胞介素－１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１β，ＩＬ－１β），然后引起肝细胞死亡；当Ｎｒｆ２被激活后，ＴＮＦ－α，ＩＬ－６和ＩＬ－１β的产生明显受到抑制，且肝脏炎症反应减轻［１０］。而在Ｎｒｆ２基因敲除小鼠中，观察到小鼠死亡增加和肝细胞增殖延迟。当发生氧化应激时，Ｎｒｆ２、ＮＱＯ－１表达下调，Ｋｅａｐ１表达上调［４］，线粒体功能障碍，ＡＴＰ合成减少，细胞凋亡，最终导致肝组织损伤。本课题组前期研究发现局部注射Ｐｇ－ＬＰＳ建模的牙周炎大鼠肝组织出现脂肪性变，且肝组织内促炎因子ＴＮＦ－α、ＩＬ－６和ＩＬ－１β的表达明显升高［１１］。为了进一步验证Ｎｒｆ２在牙周炎诱发大鼠肝损伤中的作用，本实验通过采用０．２ｍｍ正畸丝结扎大鼠单侧上颌第一磨牙牙颈部并接种Ｐｇ的方法建立牙周炎模型，连续６周后，分别检查牙周状况和肝组织改变。牙周炎组大鼠牙周组织出现明显炎症反应。ＨＥ染色结果显示，正常组大鼠肝组织中肝索结构及肝细胞形态正常。相反，牙周炎组大鼠肝组织中肝索结构紊乱，弥漫性肝细胞变性，排列混乱，肝细胞内出现浅染的大小不一的空泡样变；ｑＲＴ－ＰＣＲ和免疫组织化学结果分别显示牙周炎组大鼠肝组织中Ｎｒｆ２的ｍＲＮＡ和蛋白表达水平较正常组明显降低。以上结果说明Ｎｒｆ２在牙周炎诱发大鼠肝损伤中发挥重要作用。但是否直接通过Ｎｒｆ２下调诱发大鼠肝损伤还需要进一步的研究，以期待从口腔医学视点为肝脏相关疾病的防治开辟新思路。

　　作者：李艳 夏博园 李鑫 丁旭 王闻天 于维