人乳头瘤病毒疫苗申报及药学

　　自2006年世界上首支人乳头瘤病毒(HPV)疫苗注册上市以来，多家国内企业开始了HPV疫苗的研发及申报工作。为引导HPV疫苗的良性有序研发和申报，加强申报前的研究，提高申报资料的质量，本文对目前在我国已上市的HPV疫苗，处于上市注册申请阶段、临床试验阶段、临床试验申请阶段的HPV疫苗进行了梳理，并对其申报资料中存在的药学问题进行了汇总，此外对HPV疫苗公开研讨会形成的药学共识进行了归纳。

　　［关键词］人乳头瘤病毒疫苗;申报现状;药学研发思考

　　2006年，世界首支人乳头瘤病毒(HPV)疫苗在美国上市，可以预防疫苗覆盖血清型人乳头瘤病毒感染及由此导致的宫颈癌等相关疾病，因而引发广泛公众关注。自此，多家国内企业开始了HPV疫苗的研发及申报工作。截至目前，HPV疫苗的临床试验申请已超过20个，同时多家申报企业的研发水平参差不齐，部分研发项目质量不高。为加强申报前的研究，提高申报资料的质量，引导HPV疫苗良性有序研发和申报，本文对目前在我国已上市的HPV疫苗及处于上市注册申请阶段、临床试验阶段、临床试验申请阶段的HPV疫苗进行了梳理，并对其申报资料中存在的药学问题进行了汇总，此外对国家药品监督管理局药品审评中心召开的HPV疫苗公开研讨会上形成的药学共识进行了归纳。

　　1已上市及上市注册申请阶段的HPV疫苗

　　目前，国际上已有3种HPV疫苗获准上市使用，分别为2价疫苗(HPV16/18)、4价疫苗(HPV6/11/16/18)及9价疫苗(HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58)，以上产品均于近年在中国获准上市。2019年12月，首家国产HPV疫苗(HPV16/18)获准上市。此外，由另一家国内企业研制的2价HPV疫苗(HPV16/18)目前正处于上市注册申请阶段。相关情况见表1。

　　2已获批临床试验及临床试验申请阶段的HPV疫苗

　　近年来共有15个HPV疫苗的临床试验申请获得批准(不包含已上市及上市申请阶段的产品)，详见表2。经对各申报产品进行梳理，发现自2014年开始，HPV疫苗的临床试验申请明显增加。不同企业研发的HPV疫苗主要在表达体系、抗原型别与含量、纯化工艺、佐剂类型等方面存在差异。HPV疫苗的价数呈上升态势，从最开始的2价疫苗到最近的14价疫苗，其中还包括3价、4价、6价、9价和11价疫苗。表达系统方面，主要采用大肠杆菌、酵母(汉逊酵母、毕赤酵母)、昆虫细胞-杆状病毒。此外，同一家研发企业多进行不同价数的HPV疫苗的研发及申报。

　　2．1申报资料中普遍存在的药学问题及建议

　　2．1．1工程菌①已申报的HPV疫苗所选用的氨基酸序列来源各有不同，不同企业选用序列间存在差异，与已上市产品所用序列之间也存在差异。申请人需说明目的基因的来源，选择的依据，所选序列的保守性和代表性，并与已上市HPV疫苗L1蛋白的氨基酸序列做对比，分析可能对免疫原性的影响。若存在目的基因改造情况，需明确此改造是否影响病毒样颗粒(VLP)的结构和免疫原性。多家企业的目的基因存在N端/C端截短情况，需提供截短的依据及研究数据，说明是否进行过全长序列产品、不同截短序列与申报产品的质量特性、免疫原性等方面的比较。②需提供外源基因在工程菌中的整合状态的研究结果，包括整合位点、整合状态、拷贝数分析等。2．1．2生产工艺①需提供各纯化工艺步骤及解聚重聚工艺(若有)对工艺相关杂质(宿主细胞蛋白、DNA、DTT、甲醇等)和产品相关杂质(包装不完整的VLP颗粒、不完整的L1片段等)的去除效果及抗原回收率的研究资料。②建议采用动态光散射仪(DLS)、SEC-HPLC等方法对解聚过程的粒径和纯度进行动态监测，确定适宜的工艺参数;建议将VLP粒径分布及分散度等作为关键工艺控制参数进行工艺过程控制。③需提供解聚前后VLP均一度(纯度、VLP粒径及分布等)、稳定性及免疫原性影响等方面的研究数据，并进行对比分析。2．1．3质量标准和检测方法①单价原液:工艺相关杂质残留应纳入原液的质量标准;结构确证项目需包括N末端氨基酸序列测定、肽图分析、分子量、等电点、VLP粒径等;应同时进行不同原理的纯度检测，SDS-PAGE分析检测纯度，其中电泳法检测纯度应包括总L1蛋白和L1蛋白单体百分比。②吸附原液:若采用各单价原液与铝佐剂分别吸附后进行混合配制成半成品，即“先吸附后混合”方式的，需对单价吸附原液进行质控;若采用各单价原液按比例混合，配制成九价混合液后再与佐剂吸附，即“先混合后吸附”方式的，需对吸附后原液进行质控。质控项目一般包括无菌检测、pH值、铝含量、吸附完全性等项目。③成品:需同时进行体内效价和体外效价的检测。④佐剂:目前申报产品选用不同的铝佐剂(氢氧化铝或磷酸铝)，均应参照《预防用疫苗铝佐剂技术指导原则》(征求意见稿)［1］进行相关研究和质量标准的制定。⑤检测方法:WHO在《关于保证重组人乳头瘤病毒类颗粒(VLP)疫苗安全性、有效性及质量的建议(WHO/BS/2015．2252)》中指出，中和抗体是评价HPV疫苗诱导的免疫反应是否有保护作用的金标准［2］。药效学研究中建议使用假病毒中和试验来检测动物血清中的中和抗体滴度，以评估疫苗的有效性。若现阶段体内效力检测采用其他方法，如Elisa，应与效价检测金标准中和抗体检测方法进行比对验证;建议临床期间进行多批成品中和抗体效价检测数据的积累，进行结合抗体效价和中和抗体效价相关性的研究，根据研究结果确定适宜的效价检测方法。需提供体外效价检测所用单抗的来源、中和表位、是否针对优势表位等相关研究资料。目前申报产品的宿主DNA残留检测多采用《中国药典》2015年版三部通则3407“外源性DNA残留量测定法”第一法“DNA探针杂交法”测定。下文公开研讨会确定的DNA残留的质量标准(不高于10ng·剂－1)也是基于该方法。有些申报企业采用药典通则第二法“荧光染色法”或自建荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)法进行宿主DNA检测，基于不同检测方法的残留比较及标准建立是目前技术审评的难点。在此种情况下建议申请人充分验证DNA残留检测方法，以证明方法的可行、合理，建议关注使用该方法在纯化前后对DNA残留的检测结果，建议采用目前国内外较为公认的试剂盒。2．1．4结构确证①需对SDS-PAGE中目的蛋白以外的条带进行分析，确认其属性;需对色谱和质谱图中的未知峰进行归属分析。②作为涉及HPVL1蛋白折叠正确及组装完整性的标志，需进行二硫键和游离巯基的研究。③建议开展C端序列确认研究;建议开展圆二色谱、傅立叶变换红外(FT-IR)光谱法以及差示扫描热量法(DSC)等二、三级结构分析研究。④若结构确证研究表现出产品结构不均一，建议对不均一成分进行进一步分析(如截短形式、翻译后修饰等方面)，并结合临床期间变更所需的可比性研究进行多批产品扩展理化研究及结构确证的分析。2．1．5制剂处方目前申报产品均选用氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂，吸附工艺选用“先吸附后混合”或“先混合后吸附”。无论申报产品的制剂处方是否参考已上市HPV疫苗，申请人均需开展抗原和佐剂用量及吸附工艺的合理性研究，建议开展不同型别抗原与佐剂吸附效力差别的研究，为制剂工艺的合理性提供支持性依据。2．1．6稳定性成品的稳定性考察项目应包括产品的敏感性指标，如蛋白纯度、VLP粒径、抗原含量(体外相对效力)、体内效力试验、吸附度等。

　　2．2临床试验批件中遗留的药学问题

　　多数进入临床试验的HPV疫苗在其批件中均有遗留的药学问题，要求其在临床试验期间完成，现对此类问题汇总如下:①临床试验期间需进一步完善产品质控、结构确证研究，完善方法学验证、稳定性研究，参考相关指导原则进行规范的成品与包材的密封和相容性研究。②建议采用经全面结构确证的Ⅲ期临床研究批次作为今后上市原液及成品质控的参考品或理化对照品。③建议进行体内/体外效价与临床安全有效性相关性及体内-体外效价相关性的研究。

　　3未获批临床试验的HPV疫苗

　　近年来没有获批临床试验的HPV疫苗共有3个(详见表3)，现对其未获得批准的主要药学理由进行总结(以下列举缺陷不包括申报产品全部的研究缺陷):①某产品与已上市的VLP疫苗不同，是以五聚体蛋白形式存在，虽然申请人从基础理论上阐述了五聚体疫苗的免疫保护性，但未进行动物模型的保护性研究，尚不清楚五聚体疫苗在动物体内是否可以诱发中和抗体;且未进行五聚体疫苗与VLP疫苗的在免疫原性方面(包括中和抗体)的对比性研究以证明选择五聚体疫苗的可行性。②某产品的申报资料质量及产品质量研究结果均不支持其进入临床试验研究，如申报阶段未确定临床试验用样品的生产工艺路线，申报资料前后矛盾，原液及成品质控存在较大缺陷。③原国家食品药品监督管理总局2003年颁布的《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》明确规定，以简化生产工艺为目的在产品中引入的额外多肽片段如His-tag，在最终产品中应尽可能去除。而某产品在后期纯化过程中未去除某些型别L1蛋白N端引入的His-tag，且本品并非必须使用His-tag。故认为本品有可能给临床带来不必要的安全风险，建议申请人去除His-tag再行申报。此外，以上某产品由于申报之时4价HPV疫苗和双价HPV疫苗已在国外上市并在中国进入临床研究，而本品为单价疫苗，其覆盖面积不够，故建议进行多价疫苗的研制。

　　4HPV疫苗公开研讨会形成的药学共识

　　国家药品监督管理局药品审评中心于2017年3月召开了HPV疫苗公开专题研讨会，以推动HPV疫苗的研发和审评工作。会议结合国际技术指南要求、专家意见及我国申报品种现状，形成了对此类疫苗病毒型别选取、临床试验终点、药学质控等方面的研发和审评考虑要点，供业界参考。现对该研讨会及后期疫苗适应证团队内部讨论的药学问题予以总结。根据研讨会专家建议，为使我国公众更多获益，今后HPV疫苗研发在符合技术标准的前提下，应引导支持覆盖更多中国人群宫颈癌相关疾病的主要高危病毒型别的多价(9价及9价以上)疫苗，可根据研发质量和水平列入优先审评程序，以集中审评资源与临床资源，鼓励符合主流导向的疫苗研发。对于9价以下的多价候选疫苗，考虑到今后此类疫苗上市申请阶段可能出现高危型别覆盖率更高的同类疫苗已上市的情况，申请人在立题时需充分考虑所研发的产品与高价次疫苗免疫衔接的问题，并从风险-获益角度充分评估研发产品的临床价值或优势。过多型别组合将影响我国HPV上市后使用的规范性，建议申请人在选择与已上市低价次产品组合成不同产品立项时应慎重考虑。为鼓励先进生产工艺的研发，引导申请人在临床期间逐步提升生产工艺、优化产品质量，并为保证今后上市疫苗质量可比，质控体系规范、统一，为HPV疫苗一致性评价奠定基础，经专家讨论形成了HPV疫苗药学质控技术审评的考虑要点。

　　4．1质量标准的研究及质控项目

　　应同时考虑VLP疫苗特点及重组产品特点进行HPV疫苗全面的质量研究并建立质量标准。建立的质量标准整体上应不低于WHO及欧盟HPV疫苗的相关技术指南要求。在满足国际规范的基础上，需考虑自身工艺特点增加必要的质控项目。结合目前重组产品的质控要求，建议纯化液检定增加分子量、肽图、电荷异质性(等电点、离子交换纯度等)、N端测序、内毒素等检定项目。对于目前质控过程中存在问题较多的项目建议如下:①肽图:应在对肽图峰进行归属的基础上建立相关标准，尤其关注中和表位的确证;应该通过方法学优化和验证以确保肽图检测结果的稳定性。②电荷异质性:建议在现有分子量大小原理纯度控制基础上，增加电荷异质性纯度的检测研究，可考虑等电点检测、离子交换色谱检测等方法。③N端测序:建议进行N端测序监测乙酰化程度及N端序列分布情况;可根据具体情况采用Edman法或质谱法等方法。④宿主细胞残留DNA限度:宿主细胞DNA残留应达到欧洲药典要求，除根据多批产品检定结果及工艺验证结果对各型纯化液建立适宜的DNA残留限外，还应保证拟定的残留DNA限度可达到成品总DNA残留不高于10ng·剂－1的要求，并在适宜的阶段进行成品总DNA残留的限定。

　　4．2体内/体外效力试验检测方法及标准品的统一

　　专家认为，体内/体外效力试验(包括临床血清中和抗体检测)检测方法及标准品的统一对HPV疫苗一致性评价及今后国家标准品的建立均有重要意义，但无论是体内效力还是体外效力标准品的建立均存在一定的难度和不确定因素。考虑到不同的表达体系、不同生产工艺产品特性不同及研发期间不断的产业化放大对标准品及方法统一带来一定的不确定性，国家标准品建立需要较长的周期。现阶段建议申请人参考欧洲药典要求，至少选用一批经关键性临床试验验证的样品建立产品特异性参考品;在此基础上通过与中国食品药品检定研究院协作建立国家统一的体内/体外效力检测的参考品及统一的检测方法。抗体标准品在协标时，建议借鉴国际先进经验，扩大样本的代表性，选择免疫后血清、患者血清等标准证实标准品和方法的适用性。建议研发单位关注专家研讨会形成的共识，临床期间优化工艺及产品质量，并配合国家检定机构进行标准品及检测方法统一的研究。

　　5结语

　　目前，我国已有3种进口HPV疫苗、1种国产HPV疫苗获准上市使用;有1个国产HPV疫苗处于上市注册申请阶段;15个产品的临床试验获得批准。为加强申报前研究，提高申报资料的质量，引导HPV疫苗的良性有序研发和申报，本文对以上产品的基本信息进行了梳理，汇总了其申报资料、临床试验批件中存在或遗留的主要药学问题，并归纳了HPV疫苗公开研讨会达成的药学方面共识，希望同类品种的研发及申报单位给予关注，慎重决策，以推动HPV疫苗产业的健康发展。

　　作者：任慧梅 李敏 罗建辉